Genová exprese, stavba a funkce nukleových kyselin a bílkovin proteosyntéza Více na: http://snadnaskola.cz/genova-exprese-stavba-a-funkce-nukleovych-kyselin-a-bilkovin-proteosynteza/#ixzz4JYYxxadR
Centrální dogma molekulární biologie je mechanismus založený na přenosu genetické informace do další generace nebo do podoby bílkoviny. Standardně probíhá pouze replikace DNA nebo procesy transkripce a translace, avšak některé viry, umožňují syntézu DNA z RNA.
DNA
- Deoxyribonukleová kyselina
- jedním z typu nukleových kyselin
- velice důležitá pro uchování genetické informace
- Stavba
- nukleotid složen ze 3 složek:
- báze: adenin, cytosin, guanin a thymin
- cukerná složka: deoxyribosa
- zbytek kyseliny fosforečné
- z nukleotidů vzniká dlouhý řetězec, kdy se jednotlivé nukleotidy váží fosfodiesterovou vazbou
- nukleové kyseliny obsahují desítky, tisíce až miliony nukleotidů
- Primární struktura – dána pořadím nukleotidů
- Sekundární struktura – DNA je pravotočivá šroubovice složená ze dvou řetězců – dva polynukleotidové řetězce (vlákna) jsou na základě komplementarity spojeny pomocí vodíkových můstků
– vlákna jsou antiparalelně komplementární -> jedno jde od 3‘ k 5‘ konci, druhé od 5‘ ke 3‘ konci
– malý a velký žlábek -> kroutí se to nepravidelně, vždy jedna strana je větší
REPLIKACE
- semikonzervativní proces -> u nově vytvořené DNA je jedno vlákno původní (templát), druhé je k němu nově vytvořené
- probíhá rychlostí 1 000 párů bází za sekundu
- Enzymy
- opoizomeráza
- v původní dvoušroubovici dočasně štěpí vazby mezi cukrem a fosfátem, aby docházelo ke snadnějšímu rozmotávání helikázou a zamezilo se utahování
- helikáza
- rozmotává šroubovicí rozpouštěním vodíkových můstků mezi bázemi
- umí jezdit jen po jednořetězcovém úseku
- může působit i v několika místech DNA, ale vždy začíná na replikačním počátku
- SSB proteiny
- po oddělení vláken drží jednotlivá vlákna od sebe a zamezují pospojování bází v rámci vlákna
- primáza = RNA-polymeráza
- vytváří primer (očko) – asi 9 nukleotidů; aby se mohlo odněkud začít syntetizovat
- na vedoucím řetězci stačí 1 primer, na zpožďujícím se je primer každých 100 – 200 bází u eukaryot, u prokaryot každých 1000 – 2000 bází
- očka jsou ale RNA, tudíž musí být později nahrazena DNA bázemi
- může udělat několik oček za sebou (na zpožďujícím se řetězci) -> vznik Okazakiho fragmentů
- DNA-polymeráza
- připojuje v okolí volně se pohybující nukleosid-trifosfáty (podobné ATP), které po odštěpení 2 fosfátových zbytků napojí na vznikající řetězec díky obrovskému množství energie, které vzniklo po rozštěpení vazby
- prokaryota
- DNA-polymeráza I -> vykousne RNA primer a nahradí ho DNA úsekem
- DNA-polymeráza III -> elongační, staví řetězec – napojuje báze na očka ve směru 5‘ k 3‘ u nového vlákna (na 3‘ je -OH skupina, na kterou se dá připojit fosfát, na 5‘ už jeden fosfát je)
-> exonukleázová aktivita – opravný mechanismus (zpětné vystřihnutí špatného nukleotidu – ve směru 3‘ -> 5‘)
- ukaryota
- DNA-polymeráza α – navazuje na očko
- DNA-polymeráza δ – elongační funkce
- žádná DNA-polymeráza neumí vyštípnout primer, ale umí ho nahradit (vyštípne ho RNáza H od 5‘ k 3‘)
- doprovázena kruhovým proteinem, který ji na řetězci přidržuje; ve chvíli, kdy narazí opět na část se 2 řetězci, oba se odpojí
- DNA-ligáza
- spojuje dva vedle sebe ležící nové úseky DNA (Okazakiho fragmenty) nebo očko s novým řetězcem
- na místě počátku replikace a na zpožďujícím se řetězci
Průběh replikace u prokaryot
- Bakteriální genom je tvořen jedinou kruhovitou molekulou DNA
- Iniciace replikace
- vzniká pouze 1 replikační počátek (1 bublina resp. 2 replikační vidlička jdoucí opačnými směry)
- počátek vzniká tam, kde je podezřelá sekvence – četná A-T spojení -> lépe se oddělují, protože jsou spojeny jen 2 vodíkovými můstky
- methylované báze – na bázích, které mají být součástí budoucího replikačního počátku, je navázána methylová skupina (CH3), která DNA označuje jako připravenou pro replikaci
– pokud nejsou, nemůže replikace proběhnout -> poslední možnost regulace replikace
– nový řetězec je také zmethylován poté, co je zkontrolována jeho správnost (pokud by methylace proběhla již před nalezením chyby, nedalo by se poznat, který řetězec byl původní a mohlo by dojít ke zničení původního správného řetězce místo nového špatně nasyntetizovaného)
- iniciátorové proteiny – najdou to zmethylované místo
- helikáza – následuje iniciátorové proteiny a začíná vytvářet jednořetězcové úseky
- primozom – helikáza + primáza (pracují společně)
– po něm nasedá DNA-polymeráza a je možné zahájit replikaci
- Průběh replikace
- DNA-polymeráza III nasedne společně kruhovým proteinem k místu primeru, který vytvořila primáza
- vytváří nový řetězec na základě komplementarity k templátu díky volně se pohybujícím nukleotidům, které vychytává
- volné nukleotidy mají 3 fosfátové zbytky – pro navázání nukleotidu na řetězec je potřeba energie, která se získá odštěpením dvou fosfátových zbytků -> nukleotid napojený na řetězec má pouze 1 fosfátový zbytek
- RNA primer vyštípne DNA-polymeráza I a místo něj naváže DNA sekvenci
- Okazakiho fragmenty a primer s řetězcem u vedoucího řetězce spojuje DNA-ligáza
- Terminace replikace
- není známo, jak vypadá
- replikací může u prokaryot probíhat několik za sebou, přičemž předchozí replikace nemusí být ještě dokončena – na novém řetězci se opět dosyntetizují methyly a replikace může probíhat zase -> např. u množení bakterií, když se mají dobře
Průběh replikace u eukaryot
- probíhá před dělením buňky v S-fázi (musí se nakopírovat DNA, aby se mohla buňka rozdělit)
- Iniciace replikace
- pro zahájení replikace je nutné, aby DNA nebyla methylovaná, neboť methylovaná část je neviditelná pro enzymy
- na jednom chromozomu je několik replikačních počátků
- velmi komplikovaná -> účastní se jí hodně proteinů
- o rozvíjení dvoušroubovice se stará helikáza, která ale není spojena s primázou stejně jako u prokaryot
- Průběh replikace
- DNA-polymeráza α naváže za primer asi 20 nukleotidů, poté je nahrazena hlavním replikačním enzymem
DNA-polymerázou δ na zpožďujícím se řetězci a DNA-polymerázou ε na vedoucím řetězci
- žádná DNA-polymeráza nemá exonukleázovou aktivitu (neumí opravovat chyby)
- Okazakiho fragmenty spojeny DNA ligázou
- Terminace replikace
- Primer na 3‘ konci zpožďujícího se řetězce je třeba nahradit DNA, ale žádná z DNA polymeráz není schopna syntetizovat DNA bez navázání se na hydroxylovou skupinu předchozího nukleotidu
- musí se zabránit zkracování se DNA o tyto kousky řetězce při každé replikaci
- telomeráza – enzym, který rozpozná konec zpožďujícího se řetězce a za použití RNA templátu (5′-TTAGGG-3′ u člověka) dosyntetizuje DNA na původní řetězec (prodlouží ho)
- na tuto nově nasyntetizovanou DNA je možno připojit díky primáze primer a od něj může zase DNA-polymeráza a dosyntetizovat zbytek DNA -> DNA je zreplikovaná celá
- Koncový primer je poté odstraněn
- nový řetězec musí být smotán histony -> z původní DNA jich je ale k dispozici jen polovina, proto se musí v S-fázi vytvořit
Průběžná kontrola a opravy
- Během replikace
- díky DNA-polymeráze
- pokud dojde k připojení nekomplementární báze, nedochází k vytvoření vodíkových můstků mezi bázemi a kos řetězce volně plandá
- volně plandající část se chytne do reparačního místa DNA-polymerázy a vadný nukleotid je nahrazen správným
- oprava probíhá od 3‘ k 5‘ konci
- Postreplikační úpravy
- občas vznik „bubliny“ -> v nově vzniklé DNA je mezera, neboť nukleotidy nepárují (např. tautomerie = C se chová jako T)
- Enzymy vyštípnou bublinu + kus řetězce a poté správně dosyntetizují již bezvadný řetězec
- aby nedocházelo k vyštípnutí původního (správného) řetězce, nechává se nový řetězec ve formě fragmentů
-> DNA-ligáza pracuje až po zkontrolování
RNA
- vzniká podle genetické informace zapsané v řetězci DNA procesem transkripce
- primárně jednořetězcová
- dvouřetězcové úseky
- konvenční – komplementarita, která vzniká prostorovým uspořádáním -> má to tam být
- nekonvenční – komplementarita, která původně být nemá, ale vzniká při změně prostorového uspořádání RNA
- místo thyminu má uracil
- mRNA (messenger RNA)
- jednovláknová
- vzniká podle strukturních genů DNA
- zprostředkovává přenos genetické informace z DNA (jádro) do bílkoviny (cytoplazma)
- preRNA (=hnRNA) je mRNA, která zatím nebyla finálně upravena – neproběhl sestřih
- tRNA (transfer RNA)
- uplatňuje se při translaci, kde přináší AMK na ribozóm
- vytváří se v jádře
- rRNA (ribosom RNA)
- společně s proteiny tvoří ribozomy, kde dochází k syntéze proteinů
- v jadérku dochází k setkání rRNA a proteinů a tím k vytvoření malé a velké podjednotky ribosomů
- snRNA (malé jaderné)
- mají uplatnění při sestřihu, nejsou příliš probádané
- miRNA (mikro)
- může se navázat na jednořetězcovou mRNA a vytvořením ds řetězce bránit její translaci. Je to jeden z mechanismů regulace, který byl objeven nejdříve u rostlin.
- siRNA (malé interferující)
- funguje podobně jako miRNA
- vzniká z nepůvodní dvouřetězcové DNA (např. od virů), která je naštípána na malé kousky
TRANSKRIPCE
- u bakterií se odehrává volně v cytoplazmě, u eukaryotických organismů probíhá v buněčném jádře
- podle 1 genu v DNA vzniká 1 typ mRNA
- nový řetězec se syntetizuje od 5‘ ke 3‘ konci
- určitý gen se může najednou transkribovat několikrát (těsně za sebou) -> přijde hodně RNA-polymeráz a každá si vytváří svou transkripční bublinu
- transkripční bublina – asi 9 nukleotidů
– otevře se na chvíli a začíná se posouvat (nukleotidy mají tendenci se zase hned zavírat)
- housekeeping geny – geny DNA podléhající transkripci neustále nebo častěji než jiné
– DNA a RNA-polymerázy, klatríny, membránové enzymy a proteiny
- heat-shock proteiny – vznikají občas, např. při vysokých teplotách (chrání bílkoviny před denaturací)
– opak k housekeeping genům
Průběh transkripce u prokaryot
- k RNA-polymeráze (pouze 1 typ) se připojí σ-faktor (koenzym)
- tento komplex nasedne na 1 řetězec DNA a hledá promotor
- promotor
- sekvence nukleotidů
- síla promotoru – odpovídá pravděpodobnosti, s jakou si na to nasedne RNA-polymeráza s σ-faktorem
– čím je silnější, tím častěji probíhá transkripce toho genu
- vyskytuje se v oblasti -35 a -10 na řetězci DNA (odpočítáno od oblasti č. 1 = 1. transkribovaný nukleotid)
- určuje, který ze dvou řetězců DNA má být transkribován
- po vazbě RNA polymerázy s σ-faktorem na promotor se začíná vytvářet transkripční bublina
- RNA-polymeráza se začíná posouvat, posouvá s sebou i tu bublinu a podle 1 řetězce DNA vytváří řetězec RNA, který leze ven speciální rýhou v RNA-polymeráze
- mezitím dochází k uvolnění σ-faktoru
- terminátorová sekvence
- hodně A-T nukleotidů (slabší vazba)
- podle ní vzniká posledních prát nukleotidů na RNA
- vznik speciálního útvaru (často vlásenka)
- odpoutání RNA-polymerázy
- operon
- za jedním promotorem se může transkribovat víc genů -> leží za sebou a mají i logickou návaznost)
- např. laktózový operon e. coli -> normálně zpracovává glukózu, ale díky němu se umí přepnout na zpracování laktózy
Průběh transkripce u eukaryot
- typy RNA-polymeráz
- RNA-polymeráza I a III – vznik tRNA, rRNA, snRNA
- RNA-polymeráza II – vznik mRNA
- důležité sekvence
- promotor
- enhancer
- Iniciace transkripce
- TATA box
- součástí promotoru
- v oblasti -25 (25 nukleotidů před 1. transkribovaným nukleotidem)
- převládají nukleotidy A a T
- na TATA box nasedá transkripční faktor 2D (podle RNA-polymerázy II) a váže se tam místem TTB
- 2D faktor následují další obecné faktory 2, a tím se vytváří preiniciační komplex
- na preiniciační komplex nasedá RNA-polymeráza II
- specifické transkripční faktory
- integrují s komplexem
- zvláštní pro každý den (obecné faktory jsou vždycky stejné)
- díky nic může začít transkripce -> je jimi dáno, jaký gen se bude transkribovat
- DBD – váže se tím na řetězec DNA
– u všech specifických transkripčních faktorů stejné
– díky tomu největší genetická rodina eukaryotických buněk (rodina = mají společný základ nebo znak)
- Hox-geny – určují přesné fungovaní nějakých částí těla (tykadla a nohy u hmyzu jsou podobné,ale díky
Hox-genům mají různé funkce)
- aby mohla začít transkripce, musí dojít k fosforylaci RNA-polymerázy pomocí 140 fosfátových zbytků, a tím se
RNA-polymeráza uvolní
- vliv mají i chemické procesy – fosforylace(kosfokinázami) a defosforylace (fosfatázami) jednotlivých složek
- Elongace
- Nadšroubovicové vinutí
- DNA se zamotává do smyček, před transkripčním faktorem jsou – smyčky a za ním + smyčky.
- Záporné smyčky rozvolní DNA v místě, kde se má vytvořit transkripční bublina a nasedne RNA polymeráza.
- Kladné smyčky jsou důsledkem rozmotávání a jsou nutné pro to, aby nedocházelo k utahování šroubovice v důsledku posouvání bubliny
- Terminace transkripce
- signálem pro ukončení transkripce je methylguanosinová čepička a poly-A-sekvence
- Posttranskripční úpravy (RNA processing)
- úpravy konců řetězce, tak aby RNA nebyla mimo jádro ihned rozložena
- methylguanosinová čepička
- lepí se na začátek vznikající mRNA
- díky čepičkovým faktorům – vážou se na 5‘ konec vznikající mRNA, ale vážou se přes 5‘ konec, což není běžné
- způsobí neviditelnost řetězce pro enzymy
- poly-A-sekvence
- hodně adeninů za sebou
- na 3‘ konec nasedá poly-A-izomeráza
- tím je zaručen bezpečný transport mRNA k místu translace
- sestřih (splicing)
- RNA obsahuje kódující i nekódující sekvence, je třeba některé úseky vystřihnout
- splicezom
- tvořen 5 snRNA a 50 enzymy
- odliší introny na základě sekvence nukleotidů, který je pro introny typický
- výsledkem celého sestřihuje spojení dvou sousedních exonů
- dochází uvolnění intronu v lasovité podobě, který ne později odbourán
- podle exonů vznikají při translaci proteiny
TRANSLACE
- překlad informace z jazyka nukleových kyselin (RNA) do jazyka bílkovin
Genetický kód
- univerzální (eukaryota i prokaryota mají aminokyseliny kódované stejně)
- degenerovaný (redundantní) – jedné aminokyselině odpovídá 1 – 6 tripletů
- Aminokyseliny
- 20 + 2 vzácné
- selenocystein – u eukaryot i prokaryot
- pyrolysin – u sinic
- stop-kodón
- nenavazuje se na ně už tRNA s AMK
- mohou se na ně navázat ty vzácné AMK – pokud mRNA vytvoří vlásenku a speciální bílkovina přinutí ribozom, aby vzácnou AMK na sekvenci
stop-kodónu navázal
- čtecí rámec
- AMK se čtou po trojicích (triplet, kodón)
- záleží na tom, kde začínáme čtecí rámec číst
- k posunutí dochází, vypadne-li nějaký nukleotid (nebo více)
- při vypadnu tří nebo násobku tří nukleotidů jdoucích za sebou, se čtecí rámec neposouvá
- někdy může při vypadnutí nějakých nukleotidů a posunu čtecího rámce dojít k vytvoření stop-kodónu a translace se rychle ukončí -> velmi výhodné (hlavně z energického hlediska)
- tRNA
- má tvar trojlístku, ale dochází k přehybu dvou lístků, takže výsledný tvar připomíná L
- na jednom z lístků antikodón (komplementární s kodónem na mRNA)
- přenáší AMK (navázanou na 3‘ konci přes esterovou vazbu) k ribozómům, kde se skládají do proteinů
- AMK navazuje díky AA-tRNA-syntetáze
- má 2 vazebná místa – jedno na AMK, druhé na tRNA
- další vazebné místo je na ATP, které potřebuje jako zdroj energie pro navázání AMK na tRNA a vytvoření makroergní vazby
- makroergní vazba je zdrojem energie pro vytvoření peptidové vazby mezi jednotlivými AMK
- k mRNA se váže vodíkovými můstky
- ribozom
- tvořen velkou a malou podjednotkou, jsou spojené díky Mg2+
- funguje jako enzym -> RIBOZYM (=enzym tvoření RNA)
- volně v cytoplazmě nebo semiautonomních organelách
- prokaryotický: 70S (velká podjednotka 50S, malá 30S), eukaryotický: 80S (velká podjednotka 60S, malá 40S)
- Vazebná místa
- A – místo (amino-acylové) = váže se tam příchozí tRNA nesoucí AMK
- P – místo (peptidové) = vazba tRNA s AMK, která je už součástí tvořícího se polypeptidu (připojena peptidickou vazbou)
- E – místo (exitové) = místo, odkud se odpojuje tRNA, na kterou již AMK navázána není
- polyribozom (polyzom)
- více ribozomů na 1 mRNA -> je translatovaná víckrát za sebou
- u prokaryot i eukaryot
- Iniciace translace
- u prokaryot
- mRNA nemá methylguanosinovou čepičku ani poly-A-konec
- mRNA je polycistronní = má několik translačních počátků (více iniciačních kodónů – formylmethyonin)
- malá podjednotka vyhledává iniciační kodón
- když ho najde, napojí se na ní tRNA nesoucí methyonin
- po nasednutí tRNA se připojí velká podjednotka
- celý ribozom se začíná posouvat po mRNA a začíná translace
- u eukaryot
- mRNA, která opustila jádro, se stáčí do kruhu (methylguanosinová čepička se spojí s poly-A-koncem přes eukaryotický iniciační faktor = EIF) -> to, že je v kruhu, značí, že se může translatovat
- k místu spojení nasedne malá ribosomální jednotka, která už na sobě má tRNA s methyoninem
- společně hledají místo s iniciačním kodónem – rozpozná ho tRNA
- připojí se velká podjednotka a může se začít translatovat
- Elongace
- u prokaryot může probíhat současně s transkripcí
- do místa A se naváže tRNA s AMK
- dochází ke změně konformace – velká podjednotka se posouvá -> tRNA se dostává do místa P, vzniká peptidová vazba mezi AMK a vznikajícím polypeptidem
- pro vytvoření peptidické vazby jsou potřeba 4 makroergní vazby -> je to velmi energeticky náročné, proto je výhodné to neustále kontrolovat, aby se zbytečně neplýtvalo energií pro vytvoření nefunkčního proteinu)
-> kontroly jsou schopná pouze eukaryota
- další změna konformace – posouvá se malá podjednotka -> místo A se připraví na příchod nové tRNA s AMK a původní tRNA se přesouvá do místa E
- při přesunu do místa E se AMK odváže od tRNA a tRNA může opustit ribozom
- vytvořený polypeptid se souká z ribozomu ven speciálním tunelem, který je pokryt vrstvou, která s polypeptidem nijak neinteraguje
- už během výstupu mění polypeptid svou prostorovou konformaci -> různě se sbaluje na základě přitažlivých a odpudivých sil mezi jednotlivými AMK (balí se tak, aby ušetřil co nejvíce energie)
- elongační faktory
- kontrolují kompatibilitu tRNA a mRNA
- zároveň napomáhají vytvoření vazby mezi tRNA a mRNA
- nejsou nutné, ale proces je bez nich pomalý a nepřesný
- Terminace translace
- v místě stop-kodónu
- žádná tRNA nemá komplementární antikodón, proto se místo ní naváže release faktor (bílkovina, která je tvarem podobná tRNA -> použití molekulární mimiky (použije se něco podobného tvaru, ale jiné fce)
- místo AMK se naváže voda a tím dojde k odpojení poslední AMK od své tRNA a následnému rozpadu ribozomu na malou a velkou podjednotku
- řetězec se prosouká tím tunelem
- Kontroly translace
- kontroluje se, jestli je mRNA celá
- elongační faktory
- Posttranslační úpravy
- chaperony
- „gardedámy“
- napomáhají finálnímu sbalení proteinu
- heat-shock protein 70 -> opakovaně se navazuje
- heat-shock protein 60 -> barel, který protein zavře a pustí, až když je správně sbalen
- kovalentní úpravy – např, vznik glykoproteinů v hladkém endoplazmatickém retikulu
- špatně sbalený protein
- má na povrchu mnoho hydrofóbních skupin -> má tendence se shlukovat
- ubikvitiny – polypeptidy
– navážou se na špatně sbalený protein a označí ho
- proteosom – dutý válec tvořený asi 20 proteázami (štěpí bílkoviny)
– všimne si proteinu obaleným ubikvitiny
- pokud se to nepodaří rozštípat, může dojít ke vzniku mnoha genetických onemocnění – nemoc šílených krav (priony), Alzheimer, Huntington
