Kultivace bakterií
Kultivační půdy
Příprava kultivačních půd
Většina půd se připravuje ze sušených základů, komerčně dodávaných firmami.
Specializované půdy lze připravit dle speciálních receptur, k práci používáme zásadně sterilní sklo a pracujeme asepticky.
Krevní agar
Navážíme přesné množství kultivační půdy dle návodu. Zalejeme destilovanou vodou a rozpustíme. Je- li v půdě agar necháme ještě nabobtnat. Po nabobtnání rozvaříme při 100°C v přístroji s proudící parou. Necháme mírně prochladnout a upravíme pH půdy na 7,2. Poté sterilizujeme v autoklávu( sterilizace párou za zvýšeného tlaku).
Kde je teplota 121 nebo 134°C. Po sterilizaci půdu za stálého míchání vychladíme na 50°C. Za aseptických podmínek u kahanu vpravíme do média 5- 7 % beraních ERY. Promícháme a vyléváme do sterilních Petriho misek. V každé misce 20 ml agaru, což odpovídá 4 cm sloupci půdy v misce. To je optimální pro dobrý růst bakterií.
Kultivační půdy
Dělení půd:
- Dle původu
– přirozené se používali před mnoha lety, dnes nahrazeny umělými. Základy půd jsou distribuovány v suchém stavu.
- Dle složení
– ve výzkumu se užívá definovaných půd kde je detailně známo chemické složení. V lékařské mikrobiologii se užívají KOMPLEXNÍ půdy- definována je jen receptura.
- Dle konzistence
– tekuté, pevné a polotuhé. V tekutých se bakterie lépe pomnožují ale nelze je určit k získání čisté kultury. Pevné půdy jsou nejběžnější. Pevné se připravují z tekutých přidáním 1- 2 % agarové řasy.
- Dle účelu
- a) Základní– kultivace nenáročných bakterií k jejich uchování a výrobě ostatních půd( živný agar a bujon)
- b) Transportní– zachování vitality bakterií během cesty materiálu do laboratoře. Využívají se pro nějaké náročné bakterie nebo u ostatních bakterií pro zabránění vyschnutí tamponu při delším transportu.
- c) Pomnožovací– užíváme tam, kde je od pacienta získáno malý počet bakterií, ty se zde pomnožují před očkováním na selektivní nebo diagnostickou půdu. Bývají hlavně tekuté. Mohou obsahovat složky bránící růstu nějakých bakterií, pak jde o selektivní půdy.
- d) Diagnostické– vzniknou přidáním dalších složek které jsou nedílně metabolizovány dle druhu bakterie. Rozdíly v metabolismu se projeví různou morfologií, barvou. Patří sem KA- zde se sledují hemolytické vlastnosti bakterií. Všechny půdy k biochemickému určení bakterií, tuhé i tekuté kde podle změny barvy indikátoru nutno přidat reagens poznáme zda bakterie reakci dává, či ne.
- e) Selektivní- vznikají ze základních půd přidáním složek které brání v růstu nějakých mikrobů, a neovlivní růst bakterií hledaných. Jako selektivní složení- zvýšení koncentrace NaCl, změny pH, žluč, barviva)
- f) Selektivně- diagnostické– vlastnosti obou předchozích skupin, velmi často užívané, složka selektivní brání růstu nežádoucích mikrobů a diagnostická umožní barevné odlišení hledaných bakterií( ENDOva půda).
| Typ půdy | Základ | Inhibitor | Substrát | Indikátor |
| Základní | + | – | – | – |
| Selektivní | + | + | – | – |
| Diagnostická | (+) | – | + | (+) |
| Selektivně- diagnostická | + | + | + | (+) |
+ musí být vždy přítomno
Některé běžně užívané půdy
- Peptonová voda– nažloutlá barva, diagnostika cholery
- Živný bujon– žlutohnědá barva, příprava z masového extraktu a peptonu s malým přídavkem soli. Užívá se pro přípravu dalších půd.
- Živný agar– z bujonu s přídavkem 2% agaru, slouží ke kultivaci nenáročných mikrobů a k přípravě selektivních a diagnostických půd.
- Krevní agar– rudé barvy, je nejpoužívanější. K živnému agaru přidáváme 7% beraních ERY. Slouží k diagnostice patogenních bakterií které rozlišujeme dle jejich hemolytických vlastností.
- Čokoládový agar– hnědý, jedná se vlastně o KA který je zahřátý na 80°C, čímž se rozpadnou ERY a uvolní se růstové faktory, které jsou nutné pro růst náročnějších bakterií jako jsou Naisserie.
- Levinthalův agar– bohatá půda podobná živnému agaru, připravena filtrací čokoládového agaru. Slouží k diagnostice hemofilů.
- Lővenstein- Jensenova půda– žlutě zelený šikmý agar, slouží k diagnostice TBC( kolonie jsou podobné květáku) Je to vaječná půda, růst je pomalý 3- 9 týdnů.
- Šulova půda- tekutá, nažloutlá, slouží k diagnostice mykoTBC, roste zde jako zrníčka sedimentu.
- Selenitová půda– tekutá růžovo oranžová, slabě kalná, selektivní pro salmonely.
- ENDOva půda– nejčastější půda, je růžová, obsahuje laktózu a cudin. Je to selektivně diagnostická půda- G+ nerostou, G- jako červené pokud zkvašují laktózu, pokud světle tak ji nezkvašují.
- MacConkeyho agar– podobá se ENDOvě půdě.
- XLD( xylóza-lyzin-deoxycholát sodný)- slouží k diagnostice salmonel.
- MAL(maltóza-arabinosa-lakton)- slouží k diagnostice salmonel.